Анализ нуклеотидной последовательности гена лейкоцитарного а2 -ИФН человека в рекомбинантных штаммах-продуцентах Pseudomonas putida VG-84 и Е. coli SG 20050 plF 16, продуцирующих соответственно реаферон и реколин, показал различия в составе кодонов. Эти кодоны в силу вырожденности кода кодируют идентичные аминокислоты, а белковые молекулы имеют идентичную структуру.

Определение последовательности 6 аминокислот с N-конца и 17 аминокислот с С-конца у двух образцов подтвердило полную идентичность аминокислотной последовательности исследуемых участков белковых молекул, выделенных из разных продуцентов. Дополнительно исследовалась N-концевая последовательность аминокислот до положения 39 от конца.

Результаты также подтвердили полную идентичность аминокислотного состава и последовательности аминокислот исследуемых белковых молекул реколина и реаферона, включая аргинин в положении 23 от N-конца, что соответствует а2-2Ь-ИФН.

Пептидное картирование. Расщепление белковых молекул на фрагменты проводили трипсином, протеазой из S. anveus и бромистым цианом. Сравнение полученных гидролизатов образцов ИФН из двух различных микробиологических источников проводили методом HPLC.

Результаты показали, что профили элюции, характер и время выхода пиков совпадают и практически идентичны для соответствующих пептидных гидролизатов, что может являться одним из доказательств идентичности первичной структуры исследуемых белков.

Исследование реколина подтвердило, что новый препарат, как и реаферон, устойчив к воздействию кислой среды, в течение 4 сут и механическому стрессу в течение 30 мин, что свойственно а-ИФН.

Обработка препарата трипсином при 37°С в течение 30 мин приводила к потере реколином антивирусной активности.

Оптические свойства. Спектры поглощения белков реаферона и реколина в УФ-области идентичны. Также идентичны спектры кругового дихроизма реколина и реаферона.

Исследование молекулярной массы и чистоты белков. Идентичность реколина и реаферона, выделяемых из рекомбинантных штаммов Е. coli и Ps. putida, подтверждается также данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Это основной метод, который применяется в настоящее время для аналитического разделения белков. Он имеет высокую разрешающую способность в широком диапазоне молекулярных масс.

Реколин и реаферон имеют одинаковую относительную электрофоретическую подвижность и молекулярную массу мономерной формы, определенную из электрофореграмм, полученных в редуцирующих условиях кД, что соответствует молекулярной массе высокоочищенного а2 -ИФН.

Чистота реколина и реаферона, определенная методом электрофореза, составляет не менее 95% по мономеру в редуцирующих условиях и не менее 90% в нередуцирующих. Препараты содержат, как правило, незначительные, количественно регистрируемые примеси димерной и тримерной форм а2-ИФН и не более 2% белковых примесей неинтерфероновой природы.

Идентификация а2-ИФН и его полимерных форм в обоих случаях проведена методом иммуноблоттинга при связывании с конь- югатом моноклональных антител с пероксидазной меткой.

На электрофореграммах образцов реколина и реаферона при окрашивании полиакриламидных гелей раствором нитрата серебра присутствует только одна полоса основного вещества — мономерной формы а2-ИФН, что свидетельствует об отсутствии примесей небелкового происхождения в анализируемых субстанциях.

Хроматографическая чистота белков. Гомогенность белковых продуктов в пределах допустимости наличия димеров ИФН, обозначенной в ФС и ВФС, подтверждена методами HPLC в стандартных условиях фракционирования на сорбенте Lichcosphere Si-100-Gg,

5 мкм, с элюцией градиентом концентрации ацетонитрила от 5 до 90% в присутствии 0,1% фторуксусной кислоты.

Доказана идентичность препаратов реколин и реаферон как по структуре, так и по физико-химическим и биологическим свойствам.