Определение уровня лизоцима в биологических жидкостях методом диффузии в агаре. Лизоцим — один из неспецифических факторов защиты организма от ряда патогенных бактерий и даже вирусов. Этот фермент вызывает повреждение мембран бактерий с последующей их гибелью, как самостоятельно, так и при взаимодействии с IgA.

1. Приготовление 0,1 М раствора бифталата калия. 20,42 г сухого бифталата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Измеряют pH раствора на потенциометре. Обычно начальное pH буфера — 3,9-4. Для работы необходим буфер с pH 6,2. Доводят pH до нужного значения 10 н. раствором NaOH, а затем осторожно, по каплям, 1 н. раствором NaOH.

2. Приготовление агара. К 100 мл 0,1 М раствора фталатного буфера добавляют агар Дифко — 1г. Колбу с такой смесью ставят на водяную баню, и агар расплавляется. Хорошо растопленный раствор не должен опалесцировать. Затем агар вынимают из бани и охлаждают до температуры 45-50° С. Взвешивают нужное количество ацетонового порошка.

На 100 мл жидкого агара берут 150 мг сухой культуры. Затем ее переносят в фарфоровую чашку и тщательно растирают. Буфера берут в 10 раз меньше, чем для приготовления жидкого агара. На 100 мл жидкого агара берут 10 мл 0,1 М бифталата калия с pH 6,2. Полученную суспензию вливают в 100 мл предварительно охлажденного агара, перемешивают и разливают по 15 мл в чашки Петри. Для лучшего застывания чашки с разлитым агаром ставят в холодильник на 30-40 мин. Затем в застывшем агаре делают лунки пробочным сверлом из нержавеющей стали диаметром 8 мм. Обычно делают 5 лунок: 3 — для контрольных растворов лизоцима, 2 — для исследуемых. В каждую лунку закапывают по 0,15 мл растворов. Затем чашку инкубируют 18-20 ч при 37° С. После этого измеряют зоны лизиса вокруг лунок и определяют концентрацию лизоцима в исследуемом растворе. Калибровочную кривую строят при помощи контрольных разведений лизоцима.

3. Приготовление контрольных растворов лизоцима из кристаллического порошка. 10 мг кристаллического порошка лизоцима осторожно пересыпают в мерную колбу емкостью 50 мл и вливают в нее дистиллированную воду до метки. Получают раствор лизоцима с концентрацией 200 мкг/мл. Этот рабочий раствор может долго храниться в холодильнике.

Для получения раствора концентрации 8 мкг/мл берут пипеткой 2 мл полученного рабочего раствора лизоцима, переносят его в сухую мерную колбу и вливают в нее до метки 50 мл дистиллированной воды. Получают раствор концентрации 8 мкг/мл. Для получения концентрации 1 мкг/мл берут 0,25 мл раствора с концентрацией 8 мкг/мл, переносят его в пробирку и добавляют 1,75 мл бифталата натрия; 2 мкг/мл — 0,5 мл лизоцима и 1,5 мл бифталата натрия; 4 мкг/мл — 1 мл лизоцима и 1 мл бифталата натрия.

Количественная характеристика классического и альтернативного путей активации комплемента. Комплемент представляет собой систему белков нормальной сыворотки крови, активация которых играет важную биологическую роль в организме. Известно два основных способа активации системы С. Первым был открыт так называемый «классический путь», его инициирующим звеном является обычно комплекс антиген — антитело; второй — альтернативный, или пропер- диновый, путь с участием сывороточного белка пропердина.

В общем виде различия между классическим и альтернативным путями активации системы С касаются начальных этапов реакции. Конечная стадия в обоих случаях характеризуется формированием так называемого мембраноатакующего комплекса, обеспечивающего прямое цитолитическое действие на чужеродные клетки. Кроме того, система С в целом, а также ее фрагменты вызывают усиление фагоцитарной и лимфоцитарной активности и повышение проницаемости сосудов, стимулируя местные воспалительные реакции и способствуя, таким образом, противоинфекционной защите организма.