Буферные растворы: VBS — 5,75 г веронала, 3 г мединала и 85 г натрия хлорида растворить в 1 л дистиллированной воды, pH 7,4; VBS2 : к 2 л VBS добавить 5 мл 1 М раствора MgCb и 1,5 мл 1 М раствора СаСЬ, pH 7,4; VBS-Mo-EGTA — к 100 мл 0,1 М EGTA добавить 50 мл 0,1 М раствора MgCb. К полученному раствору долить раствор VBS до 1 л, pH 7,4.

Примечание: 1) необходимую навеску EGTA растворить сначала в 10-15 мл раствора NaOH и долить дистиллированную воду до требуемого объема; 2) все буферные растворы перед работой разводить дистиллированной водой в 5 раз; 3) в готовые буферные растворы перед работой добавить бычий сывороточный альбумин для предотвращения спонтанного лизиса эритроцитов.

Раствор Олсвера: 24,6 г глюкозы, 9,6 г цитрата натрия и 5 г натрия хлорида растворить в 1200 мл дистиллированной воды; pH довести до 6,1 с помощью 1 н. раствора лимонной кислоты. Перед работой раствор стерилизуют.

Эритроциты кролика. Кровь берут из сердца, немедленно помещают в стерильный раствор Олсвера со стеклянными бусами и встряхивают сосуд 2-3 мин. Хранят при 4° С до 2 мес.

Перед использованием эритроциты центрифугируют со скоростью 1500 об/мин 5 мин, промывают 2-3 раза раствором VBS и 2 раза раствором VBS-Mg-EGTA.

Приготовление стандартной суспензии эритроцитов:

1. Осадок эритроцитов разводят в таком количестве раствора VBS- Mg-EGTA, чтобы при добавлении к 200 мкл суспензии 2800 мкл дистиллированной воды оптическая плотность лизата при 541 нм составила 0,7. Эту стандартную суспензию можно хранить 2-3 дня при 4° С.

2. Отбирают нужный для опыта объем стандартной суспензии, разбавляют его раствором VBS-Mg-EGTA в 3-4 раза и стандартизируют так, чтобы при добавлении к 200 мкл полученной суспензии 2800 мкл дистиллированной воды оптическая плотность лизата равнялась 1.

Эритроциты барана. Осадок эритроцитов барана трижды промывают в 5-10 объемах раствора VBS2+ и центрифугируют при 1500 об/мин по 5 мин. Полученный осадок ресуспендируют в 18 объемах раствора VBS2+ и стандартизируют описанным выше способом, доводя оптическую плотность лизата при 541 нм до 0,7. Полученную стандартную суспензию хранят 2-3 дня при 4° С.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов барана необходимо для образования комплексов АГ-АТ, инициирующих реакции классического пути активации системы С.

К 10 мл стандартной суспензии эритроцитов барана добавляют 10 мл гемолитической сыворотки, разбавленной в соотношении 1 : 400 раствором VBS2+. Сыворотку вливают в эритроциты. Все тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С, периодически помешивая. Центрифугируют со скоростью 1500 об/мин 5 мин. Сливают надосадок, разбивают клетки встряхиванием. Добавляют раствор VBS2+, перемешивают. Доводят оптическую плотность лизата при добавлении к 200 мкл суспензии 2800 мкл дистиллированной воды до 1 при 412 нм. Для постановки реакции используют плексигласовые панели с лунками объемом до 100 мкл.

Титрование С при классическом пути активации. В 10 лунок заливают по 25 мкл раствора VBS2+. В первую лунку добавляют 25 мкл исследуемой сыворотки и последовательно растит- ровывают ее по всем лункам. В каждую лунку добавляют по 20 мкл суспензии эритроцитов барана и по 5 мкл VBS2+. Инкубируют 1 ч при 37° С. Контроль первый — эритроцитов: 200 мкл эритроцитов барана и 300 мкл VBS2+; второй — лизата: 200 мкл эритроцтов барана, 300 мкл VBS2+ и 2500 мкл Н2О.

Титрование С при альтернативном пути активации. В 7 лунок заливают 22 мкл раствора VBS-Mg-EGTA. В первую лунку добавляют 22 мкл исследуемой сыворотки и последовательно раститровывают по всем лункам. В каждую лунку доливают по 20 мкл эритроцитов кролика и 8 мкл раствора VBS-Mg-EGTA. Инкубируют 40 мин при 37° С. Контроль: первый — эритроцитов: 200 мкл эритроцитов кролика и 300 мкл раствора VBS-Mg-EGTA; второй — лизата: 200 мкл эритроцитов кролика, 300 мкл раствора VBS-Mg-EGTA и 2500 мкл НгО.

Оценка результатов. Титр комплемента определяют по содержимому последней лунки, в которой еще виден полный лизис; в качестве единицы измерения можно принять разведение сыворотки в этой лунке.