Довольно часто у больных с поражением печени некоторыми лекарственными препаратами находят циркулирующие антитела к эндоплазмагическому ретикулуму печени и почек, их называют антипеченочными антипочечными микросомальными антителами. Предполагают, что приобретенный иммунитет направлен на неоантигены, образующиеся при формировании ковалентных связей между токсическими метаболитами и белками гепатоцита. Часто антипеченочные/антипочечные микросомальные антитела связываются с ферментами Р450. На современном этапе считают, что если фермент Р450 вырабатывает активный метаболит, этот метаболит может ковалентно связываться с ферментом или повреждать его. Антитела формируются, если эти поврежденные ферменты Р450 обладают антигенными свойствами и располагаются на поверхности гепатоцита, где могут быть распознаны антигенпредставляющими клетками. Однако при распознавании антигена не обязательно происходит лизис клетки, так как есть предположение, что только небольшое количество ферментов Р450 располагается на наружной цитоплазматической мембране гепатоцитов. Также необходимо отметить, что большинство белков, предназначенных для цитоплазматической мембраны, синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме, где образуются большинство токсических метаболитов, и ковалентная модификация белков может происходить в эндоплазматическом ретикулуме перед перемещением в плазматическую мембрану.

Остается неясным, каким образом антитела к Р450 вызывают иммунную атаку на клетки печени, поскольку еще никто не смог убедительно доказать, что у животных эти антитела могут вызывать поражение печени. Существует вероятность, что эти антитела — лишь сопутствующий фактор, и они появляются только после выброса антигенов в циркулирующую кровь, т.е. после разрушения гепатоцитов под влиянием других механизмов. Например, замечено, что в крови анестезиологов обычно присутствуют циркулирующие антитела к CYP 2Е1, но нет признаков поражения печени.

Однако система иммунитета не атакует здоровые гепатоциты только по той причине, что на их поверхности располагаются неизвестные антигены; предполагают, что необходим второй «сигнал об опасности». Природа этого сигнала неизвестна, но есть мнение, что он присутствует в поврежденных клетках. Это соответствует наблюдениям, что вакцина работает только при введении со вспомогательными веществами, вызывающими повреждение ткани в месте введения. Если эта теория верна, токсические метаболиты могут стимулировать иммунную атаку на печень, только если образовавшиеся неоантигены вызывают повреждение гепатоцитов.

Независимо от того, способствуют ли они лекарственному поражению печени, антитела к Р450 можно использовать в иммунохимических методах исследования для определения специфических ферментов Р450 человека, участвующих в образовании токсических метаболитов, даже если структура этих метаболитов неизвестна.

Нужно отметить, что положительный результат пробы с пролиферацией лимфоцитов, как правило, более соответствует реакции на исходный препарат, а не на его метаболиты. Эти наблюдения привели к гипотезе фармакологического взаимодействия, предполагающей, что исходный препарат может запускать иммунологические реакции, приводящие к развитию нежелательных реакций на лекарственный препарат, включая токсическое поражение печени.

Токсическое поражение печени, не связанное с активными метаболитами

Хотя в целом полагают, что токсические метаболиты запускают большинство форм лекарственного поражения печени, это происходит не всегда. Например, препарат может непосредственно вмешиваться в ключевые функции гепатоцита, вызывая токсическое поражение. Один из примеиов подобного взаимодействия — это вмешательство в обмен желчных кислот, обладающих токсическим влиянием на клетки, особенно на митохондрии. Концентрацию желчных кислот в клетке контролирует скорость синтеза, поступления и выброса желчных кислот, которые обычно тесно связаны. Если препарат влияет на этот обмен, может развиваться токсическое поражение. Например, известно, что троглитазон и бозентан подавляют BSEP — белок, отвечающий за экскрецию желчных кислот, это может способствовать проявлению гепатотоксических эффектов этих препаратов.

Реакции идиосинкразии — основная причина регулирования индустрии лекарственных препаратов. В настоящее время фармацевтические компании тратят миллионы долларов на оптимизацию способов обнаружения возможного токсического действия разрабатываемого препарата на печень. «Золотого стандарта» еще нет, и методы меняются.

Для большей «гуманности» в доклинических исследованиях стараются использовать культивируемые гепатоциты человека и гепатоциты мышей с человеческими генами, участвующими в токсическом поражении. Ценность этих методов сомнительна, поскольку многие значимые гены в культивируемых гепатоцитах не работают, и невозможно сохранить культуру гепатоцитов в течение недель или месяцев, необходимых для развития реакции идиосинкразии. К тому же статистически маловероятно, что эти гепатоциты будут получены у человека, предрасположенного к токсическому действию этих препаратов. Проблема при использовании трансгенных мышей заключается в том, что еще неизвестны все гены, имеющие отношение к развитию токсических реакций.

Другой метод — это проверка соединений на их способность формировать токсические метаболиты. Обоснование этого метода заключается в том, что если образование токсических метаболитов — это необходимый этап в реакциях идиосинкразии и если эти метаболиты не образуются, то изучение многих возможных процессов, приводящих к поражению печени, нецелесообразно. Простейший способ определить потенциальную вероятность образования токсических метаболитов — это проследить за временным снижением активности ферментов Р450, отвечающих за метаболизм препарата, in vitro. Такое снижение активности может указывать на образование активных метаболитов, повреждающих ферменты. Другой метод — это масс-спектральный анализ, который позволяет определить в культивируемых клетках печени вещества, связанные с глутатионом. Более информативный метод обнаружения активных метаболитов — это введение радиоактивного изотопа в препарат, которое позволяет точно отследить, что происходит с ним в препаратах печени или в организме мыши, легко обнаружить ковалентные связи, легче определить активный метаболит. После получения информации, что препарат содержит активные метаболиты, химики могут попытаться изменить молекулу с учетом сохранности терапевтического действия и уменьшения вероятности образования токсических метаболитов.

Существует одна проблема в определении токсических метаболитов; в большинстве случаев они образуются только в небольшом количестве, и разработка некоторых препаратов будет прекращена без особой необходимости. Это достаточно большая проблема, поскольку токсические метаболиты определяют относительно поздно, когда остается только несколько молекул, из которых нужно выбрать «лидирующий состав». Это происходит потому, что методы обнаружения токсических метаболитов не обладают больной пропускной способностью, хотя скоро ситуация может измениться. Более того, некоторые механизмы токсического действия, например подавление белка, выводящего желчные кислоты, могли быть не детектированы при использовании этого метода.

Наконец, при традиционном доклиническом тестировании широкое применение получили современные геномные технологии. Они позволяют одновременно количественно определить тысячи РНК, белков и эндогенных метаболитов. По крайней мере, несколько компаний изучали крыс, получавших лекарственные препараты с известными токсическими эффектами на печень и нетоксические препараты, исследовали изменения количества РНК печени во времени, белки печени и сыворотки крови, эндогенные метаболиты печени, сыворотки крови и мочи. Цель исследований — найти определенную модель, помогающую прогнозировать токсическое поражение печени. Стандартной составляющей доклинического исследования должно стать определение белков и эндогенных метаболитов. Однако, по крайней мере, несколько компаний установили набор РНК, которые, по-видимому, соответствуют определенным формам токсического поражения печени, и при выборе лидирующего вещества их регулярно определяют, наряду с традиционными серологическими маркерами и гистологической оценкой. Эту технологию применяют также на культивируемых гепатоцитах. В одном исследовании с культивируемыми гепатоцитами человека тровафлоксацин вызывал изменения в содержании РНК, отличные от изменений, вызываемых другими фторхинолонами, которые редко вызывали поражение печени.

Остается выяснить, сократит ли применение геномных технологий в исследованиях на животных или на культивируемых гепатоцитах человека риск идиосинкразии разрабатываемых препаратов. Однако эти технологии могут ускорить доклиническое тестирование, способствовать раннему обнаружению токсичности и открытию новых биомаркеров поражения печени, что можно использовать в клинической практике.

Поражение печени: выводы

За последние годы значительно улучшилось понимание механизмов, лежащих в основе поражения печени, особенно токсичности парацетамола. Определено много новых белков, отвечающих за выраженность поражения печени и участвующих в балансе между выздоровлением и прогрессированием поражения. Кажется логичным, что различия по этим белкам частично лежат в основе предрасположенности к реакциям идиосинкразии. Однако для проверки этой гипотезы, вероятно, необходимо проведение исследований среди людей, фактически перенесших эти реакции. Недавно для регистрации таких больных и создания базы данных сывороточных и гентических характеристик была создана сеть регистрации лекарственного поражения печени. Фактором, определяющим чувствительность, вероятно, будет высокая лекарственная специфичность, и поэтому для значимых исследований необходимо будет исследовать много больных с развившимся поражением печени после приема этого препарата. Однако также вероятно, что ключевые события, влияющие на восприимчивость к препарату, происходят позже, возможно, они неспецифические и могут быть определены на группе больных с токсическим поражением печени, вызванным различными препаратами. Время покажет.