В своих воспоминаниях Н. Ф. Гамалея так описывает это важное в истории науки событие: «…на помощь Пастеру пришли знания и несравненная техника Ру, единственного врача среди них. Ру выработал для этого падежную экспериментальную методику: при помощи трепана (инструмент для просверливания кости, в данном случае черепа) вырезается кусочек из теменной кости животного и через образовавшееся отверстие под твердую оболочку вводится несколько капель взвеси из продолговатого мозга бешеного животного. Этим способом, во-первых, достигались всегда одинаковые результаты».

Итак, метод заражения был найден. Это помогло решить многие вопросы, стоявшие, словно глухая стена, перед исследователями.

Годы упорного труда понадобились для того, чтобы неизвестный, так называемый уличный вирус (т. е. мозг неизвестной заразительной силы от случайной бешеной собаки) бешеной собаки превратить в вирус, фиксированный, т. е. обладающий уже более определенной вирулентностью. Этого Пастер добился путем длительных перевивок — пассажей от одного животного другому. Для опытов были избраны кролики.

Заражая кроликов мозгом бешеной собаки, Пастер вначале вызывал у них бешенство через 12-20 дней. Продолжая заражения (пассажи), но уже от кролика кролику, используя головной и спинной мозг бешеных кроликов для очередного заражения, Пастер добился через 100 пассажей сокращения инкубационного периода до 6 дней. В дальнейших многочисленных перевивках заразительность возбудителя бешенства стабилизировалась, т. е. стала устойчивой, поэтому экспериментальное бешенство у кроликов наступало обычно на 5-6-й день после заражения.

Это явилось первым и важным достижением на пути к поставленной цели. Укорочением скрытого периода ученые добились резкого усиления возбудителя бешенства для кроликов. Устойчивость же инкубационного периода свидетельствовала об устойчивости силы вируса, о «фиксации его свойств», как говорил Луи Пастер.

Итак, материал для поисков вакцины был уже в руках. Пусть это не была чистая культура микроба, выращенная на искусственной питательной среде в стеклянной пробирке. Это была чистая культура вируса, образно говоря, в «биологической пробирке» — мозгу. Этот лабораторный фиксированный вирус большой силы мог вызывать бешенство и у человека. Конечно, не могло быть и речи об использовании его в таком виде в качестве вакцины для прививки людям.

Но как применить принцип аттенуации к вирусу бешенства, заключенному в головном или спинном мозге кроликов? Как его ослабить и чем? Неимоверно настойчивый труд, фантастически сложные эксперименты, неотступное раздумье и упорное стремление к цели принесли победу.

Методом ослабления Пастер и его ученики выбрали высушивание. Оказалось, что мозг больного кролика, высушенный в банке над едким кали в продолжении 14 дней, терял свою заразительность. Мозг же 1-2-дневной сушки был достаточно сильным, чтобы вызвать бешенство даже при обычной инкубации. При 5-6-дневной сушке вирулентность зараженного мозга заметно ослабевала и если вызывала бешенство, то после удлиненной инкубации.

Так Пастер разрешил одновременно несколько вопросов. Во-первых, разработан метод накопления возбудителя бешенства в мозгу; во-вторых, доказана связь между ослаблением возбудителя и длиной инкубационного периода; в-третьих, сушка мозга больного животного различной длительности приводила к обезвреживанию вируса, но в разной степени.

Все это позволило Пастеру рассматривать высушенный мозг кроликов как ослабленную живую вакцину и приступать к опытам предохранения животных от бешенства. Ведь предстояло предохранять от бешенства людей, метод должен быть безопасным и проверить его надо было в эксперименте на животных.